菌株的概念分類和保存

1 菌株的慨念分類

1.1、概念

標準菌株：即0代菌種，是指從菌種保藏機構獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。

標準儲備菌株：從國內(nèi)或國外菌種保藏機構獲得的標準菌株經(jīng)過復活并在適宜的培養(yǎng)基中生長后，即為標準貯備菌株。

儲存菌株：儲存菌株通常從凍干或超低溫保存的標準儲存菌株進行制備。

工作菌株：標準儲備菌株或儲存菌株經(jīng)繼代培養(yǎng)后得到的菌株。工作菌株不可替代標準菌株。

標準培養(yǎng)物：標準菌株、標準儲備菌株、工作菌株的統(tǒng)稱。

商業(yè)派生菌株：與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業(yè)衍生物。

1.2、商業(yè)派生菌株

商業(yè)派生菌株是標準菌株的商業(yè)衍生物，最常見的商業(yè)派生菌株有廣東環(huán)凱的定量工作菌株。在中國藥典2015版9203指導原則里面有提到“藥品微生物檢驗用的試驗菌應來自認可的國內(nèi)或國外菌種保藏機構的標準菌株，或使用與標準菌株所有相關特性等效的可以溯源的商業(yè)派生菌株"，也有關于可以使用合格的商品化菌株的描述“Cultures for use in compendial tests should be acquired from a national culture collection or a qualified secondary supplier"。隨著技術的進步與發(fā)展，微生物實驗室穩(wěn)定、高效的需求，用于質(zhì)控的商業(yè)化定量工作菌株的廣泛應用定是必然趨勢。

商業(yè)派生菌株要求相關特性與標準菌株等效，除此之外，還有關鍵一點就是“可以溯源"。微生物"溯源"通常包含兩層意思，一是指程序、途徑合法有序，來源和去向清晰可控；另外是技術層面的佐證，比如株水平的鑒定識別等。這兩個層面互為補充支撐，以保證菌種準確無誤、合法有效。

2 菌株的保存

2.1、 常用保存方法

短期保存：營養(yǎng)瓊脂斜面法 (4°C)

步驟：
? 將新鮮培養(yǎng)物劃線或穿刺接種于無菌營養(yǎng)瓊脂斜面。
? 于合適溫度（通常37°C）培養(yǎng)至良好生長（通常16-24小時）。
? 斜面長出新鮮菌苔后，旋緊試管蓋或用無菌膠塞密封（確保透氣）。
? 貼上標簽（菌株編號、日期、操作人），置于4°C冰箱。

保存期： 1 - 3個月（因菌種差異極大）。

優(yōu)點： 操作簡單、復蘇快。

缺點： 易污染、易變異、保存時間短、需頻繁傳代。

關鍵點： 使用新鮮培養(yǎng)物；密封防干涸；定期檢查存活狀態(tài)。

中長期保存：甘油冷凍管法

步驟：
? 制備50%無菌甘油溶液（用去離子水或生理鹽水配制，121°C滅菌15分鐘）。
? 取對數(shù)生長后期的新鮮肉湯培養(yǎng)物（OD~600~ ≈ 0.6 - 1.0）或適量無菌生理鹽水菌懸液。
? 將菌懸液與50%甘油溶液等體積混合（終甘油濃度~25%）。或直接將菌苔刮入含滅菌甘油的成品管（如下圖的環(huán)凱甘油保存管）中混勻。

? 分裝至無菌、預標記好的冷凍管（如1.5ml或2ml Cryovial管）中（通常0.5 - 1ml/管），立即置于超低溫冰箱保存。

保存期： 1 - 10年或更長（視菌種而定）。

優(yōu)點： 保存時間長、操作相對簡單、遺傳穩(wěn)定性較好、復蘇率高。

缺點： 依賴超低溫C冰箱、復蘇需解凍。

關鍵點： 確保菌體處于對數(shù)生長期（活力最佳）；甘油濃度準確（過高抑制，過低冰晶損傷）；混合均勻；快速冷凍（可先放-20°C 1-2小時再轉(zhuǎn)-80°C）；避免反復凍融。

長期保存：冷凍干燥法（凍干法）

步驟 (簡述)：
制備保護劑：常用脫脂牛奶、蔗糖、海藻糖等。
制備濃菌懸液：取新鮮培養(yǎng)的菌苔，懸浮于適量保護劑中（濃度約10⁸-10¹⁰CFU/ml）。
分裝：將菌懸液分裝至無菌凍干安瓿瓶中（0.2 - 0.5ml）。
預凍：將安瓿瓶置于-40°C至-80°C快速預凍。
冷凍干燥：將預凍好的樣品放入凍干機，在真空下升華除去水分（通常需數(shù)小時至數(shù)十小時）。
封口：凍干結束后，在真空或充氮氣條件下用火焰熔封安瓿瓶。
儲存：將封口后的安瓿瓶置于4°C或-20°C避光干燥處長期保存。

保存期： 10 - 30年或更長。

優(yōu)點： 保存時間極長、遺傳穩(wěn)定性好、占用空間小、便于運輸。

缺點： 設備昂貴、操作復雜、成本高、部分菌種復蘇率可能較低。

關鍵點： 保護劑選擇與滅菌；菌懸液濃度；預凍速度；凍干程序優(yōu)化；嚴格無菌操作；安瓿瓶封口質(zhì)量。

2.2、通用操作規(guī)范與注意事項

1. 無菌操作： 所有步驟必須在無菌條件下進行（超凈工作臺/生物安全柜）。

2. 菌株狀態(tài)： 使用新鮮、對數(shù)生長期、純培養(yǎng)物進行保存。保存前需確認純度（鏡檢、平板劃線）。

3. 標簽標識：清晰標注菌株編號、保存日期、保存人姓名、保存方法。
      使用防水、耐低溫的標簽和記號筆。
      冷凍管標簽應能耐-80°C低溫。

4. 記錄管理： 建立詳細的菌種保存登記本或電子數(shù)據(jù)庫，記錄保存信息（菌株信息、保存方法、位置、數(shù)量、復蘇記錄等）。

5. 備份原則： 重要菌株應至少采用兩種不同方法保存（如甘油管+凍干），并分置于不同地點（如同一冰箱不同層或不同冰箱），防止設備故障導致全部損失。

6. 避免反復凍融： 冷凍保存的菌株（甘油管、凍干粉、液氮管）一旦解凍復蘇，不得再次冷凍保存。應重新從原代保存管取菌培養(yǎng)后進行新一輪保存。

7. 定期檢查：
      4°C斜面：每周檢查有無污染、干涸。
      -80°C冰箱：記錄溫度，定期除霜維護。每年抽樣復蘇檢查代表性菌株。